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DIE AKTUELLE ZEIT bei LC Labs, Woburn, MA, USA ist: |
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[4α-PDD]
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| US-Dollar ($) | Euro (€) | Britisches Pfund (£) | Japanischer Yen (¥) |
M.W. 672.93
C40H64O8
[27536-56-7]
Lagerung: Bei oder unter -20 ºC lagern. Löslichkeit: Löslich in DMSO oder Ethanol. Entsorgung: A
Sicherheitsdatenblatt für dieses Produkt ansehen
Negative Kontrolle für Untersuchungen mit Phorbol-12,13-Didecanoat, Kat.-Nr. P-1925, siehe z. B. Trewyn, R.W. and Gatz, H.B. "Altered growth properties of normal human cells induced by phorbol 12,13-didecanoate." In Vitro. 20: 409-15 (1984).
Bitte Technical Note #13 für zusätzliche Informationen anfordern.
WICHTIGE NEUE ERGEBNISSE: Aktivierung von TRPV4-Kanälen durch 4α-PDD! 4α-PDD galt lange als biologisch inaktiv oder zumindest extrem schwaches Phorbolester-Analogon (d.h., eine ED50 von >25 µM für die Bindung an Proteinkinase C), jetzt wurde nachgewiesen, dass es ein ziemlich starker Aktivator für zwei TRPV4-Kanäle ist, nämlich die menschlichen VRL-2 und die TRP12-Kanäle der Maus [Watanabe, H., et al. "Activation of TRPV4 channels (hVRL-2/mTRP12) by phorbol derivatives." J. Biol. Chem. 277: 13569-13577 (2002)]. Die ED50 von 4α-PDD für die Aktivierung des TRP12-Kanals war ~400 nM, und ~185 nM 4α-PDD für den Anstig des internen Kalziumspiegels in 1321N1 Astrocytoma-Zellen, die den menschlichen VRL-2 exprimieren. Diese Versuche ergänzen frühere Veröffentlichungen, die andere als phorbolester-ähnliche Wirkungen von 4α-PDD [Reeve, H., et al. "Enhancement of Ca2+ channel currents in human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells by phorbol esters with and without activation of protein kinase C." Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 429: 729-737 (1995)] und von 4α-Phorbol-12,13-Dibutyrat (4 -PDBu) [Doerner, D., et al. "Protein kinase C-dependent and -independent effects of phorbol esters on hippocampal calcium channel current." J. Neurosci. 10: 1699-1706 (1990)] auf Kalziumströme beschrieben haben.
Da 4α-PDD in submikromolaren Konzentrationen nur wenig andere, wenn überhaupt, erkennbare biologische Wirkungen hat außer der Wirkung auf TRPV4-Kanäle, ist die Aussage von Watanabe et al. sicher gerechtfertigt, dass "4α-PDD als stabiles und verlässliches Hilfsmittel benutzt werden kann, um verschiedene Aspekte der TRPV-Kanäle zu analysieren und die Wirkung ihrer Aktivierung in in vivo-Systemen zu untersuchen". Trotzdem ist es wichtig zu betonen, dass eine absolute Selektivität von 4α-PDD für die Aktivierung der TRV4-Kanäle nicht nachgewiesen ist. Obwohl es sich im Lauf der Jahre gezeigt hat, dass 4α-PDD wenig oder gar keine Wirkung in einer Vielzahl von biologischen Ansätzen hat, könnte es sich doch nach intensiverer Prüfung bestimmter Zielsubstanzen herausstellen, dass 4α-PDD noch andere, bisher noch unbekannte Aktivitäten besitzt .
[Nebenbei möchten wir anmerken, dass die Referenz #25 in dem Artikel von Watanabe, die zur Unterstützung der These herangezogen wird, dass 4α-PDD inaktiv gegenüber PKC ist, 4α-PDD oder andere 4α-Phorbolester überhaupt nicht erwähnt. Als Hilfe für diejenigen, die Manuskripte über ihre Versuche mit 4α-Phorbolester verfassen möchten, werden wir in Kürze eine oder mehr passende Referenzen, die die niedrige Aktivität dieser Substanzen gegenüber PKC nachweisen, der Beschreibung dieses LC Labs-Produkts hinzufügen.]
[Siehe auch weiter unten bezüglich einer wichtigen Anmerkung zur Nomenklatur. Technisch gesehen ist 4?-PDD kein Phorbolester, es ist ein 4α-Phorbolester — ein kleiner aber wichtiger Unterschied — und muss daher immer als solcher benannt werden, um eine Verwechslung mit den dramatisch anderen Eigenschaften der Phorbolester zu vermeiden.]
Überraschenderweise (mit Blick auf die historischen Struktur–Wirksamkeitsdaten) ist PMA (Phorbol 12-Myristat 13-Acetat), der klassische PKC-Aktivator mit nanomolarer Wirksamkeit, 10- bis 50-mal schwächer als 4α-PDD bei der Aktivierung der TRPV4-Kanäle. Wenn sowohl PMA als auch 4α-PDD auf ein PKC-ähnliches Protein wirken würden, in einer Weise ähnlich der Aktivierung von klassischer PKC durch Phorbolester, sollte PMA um mehrere Größenordnungen stärker wirken als 4α-PDD. Watanabe et al. testeten eine Vielzahl von PMA- und 4α-PDD-Konzentrationen, und es scheint zweifellos, dass die relativen Wirksamkeiten, die man von PMA und 4α-PDD für die klassischen PKC-vermittelten Effekte erwartet, auffallend umgekehrt sind für das Phänomen der TRPV4-Kanal-Aktivierung. Darüber hinaus war PMA in manchen Assays nur ein "partieller Agonist", der nur 50-65% der 4α-PDD-Antwort hervorrief.
Die Umkehrung der Wirksamkeit von PMA/4α-PDD wiederum deutet stark darauf hin, dass 4α-PDD über einen anderen Mechanismus wirkt als der der klassischen Interaktion eines Phorbol-12,13-Diesters mit dem Phorbolester/Diacylglycerin-Rezeptortyp, den man auf der PKC-Proteinfamilie findet. Angesichts der langen Geschichte und des bisher relativ klaren Bildes, das über die biologischen Eigenschaften von Phorbol und 4α-Phorbolestern herrscht, ist die Frage nach dem Wirkungsmechanismus tatsächlich hoch interessant und die Antwort(en) könnten weit reichende Folgen für mehrere Gebiete der Pharmakologie haben.
Watanabe et al. favorisieren die direkte Bindung von 4α-PDD an die TRPV4-Kanäle als spezifischen pharmakologischen Mechanismus, der den von ihnen beobachteten Effekten zu Grunde liegt. Dennoch gibt es zum jetzigen Zeitpunkt (April 2003) anscheinend keinen wirklichen Beleg für die direkte Bindung von PMA oder 4α-PDD an TRPV4-Kanäle. So bleibt die Frage nach der genauen Wirkungsweise offen und andere, indirekte Mechanismen müssen ebenfalls in Betracht gezogen werden.
PMA und 4α-PDD haben große strukturelle Ähnlichkeiten und die Familie der hoch spezifischen Phorbolester-Rezeptoren mit den bekannten Aminosäuresequenzmotiven sind ausführlich untersucht. Daher würde, bis das Gegenteil bewiesen ist, als "der übliche Verdächtige" für eine Zielsubstanz, die die Effekte von 4α-PDD auf TRPV4 vermitteln könnte, eine Verbindung in Frage kommen, die Ähnlichkeit mit der gut bekannten Familie der Phorbolester-Rezeptoren hat, und die vielleicht kleine, aber entscheidende Unterschiede in einigen Aminosäureresten besitzt, die in bestimmten Fällen zu einer Umkehrung der üblichen verhältnismäßigen Wirksamkeit von Phorbol contra 4α-Phorbolester führen. Solch eine Zielverbindung könnte entweder ein PKC-ähnliches Protein sein oder ein anderes, möglicherweise ohne Kinaseaktivität, das einen Rezeptor vom Phorbol-Typ trägt. Die gut belegte Tatsache, dass PKC in der Lage ist, eine Reihe von Ionenkanälen zu phosphorylieren und zu modulieren, erhärtet weiterhin den Verdacht, dass eine phorbolester-ähnliche Verbindung wie 4α-PDD über ein PKC-ähnliches Molekül wirkt um TRPV4-Kanäle zu aktivieren.
Watanabe et al. haben anscheinend keine PKC-Inhibitoren verwendet, um deren Auswirkungen in ihrem experimentellen System zu testen. Wenn mehrere Kinase-Inhibitoren, von denen bekannt ist, dass sie relativ spezifisch für PKC sind, nicht in der Lage wären, die Effekte von 4α-PDD auf TRPV4-Kanäle zu verhindern, würde dieser Befund für die Hypothese einer direkten Bindung sprechen. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu betonen, dass einige PKC-Isotypen nur schwach oder gar nicht durch die gängigen PKC-Inhibitoren gehemmt werden; solche Inhibitoren sind keine brauchbaren pharmakologischen Werkzeuge. Ebenso gilt, dass sogar wenn durch Untersuchungen mit Inhibitoren die PKC-Familie als Ziel für 4α-PDD einigermaßen ausgeschlossen werden könnte, es immer noch eine Reihe anderer zellulärer Proteine gibt, die zwar keine PKCs sind aber dennoch als funktionierende Phorbolester-Rezeptoren mit hoher Affinität wirken. Diese anderen Proteine, die Phorbolester-Bindungsstellen tragen, könnten im vorliegenden Fall ebenfalls als Kandidaten für das tatsächliche Ziel von 4α-PDD gelten.
Wenn die Aminosäuresequenzen der TRPV4-Kanäle eine Region enthalten, die homolog zu Phorbolester-Rezeptoren ist, würde dies selbstverständlich nahelegen, dass die Effekte von 4α-PDD auf diese Kanäle auf eine direkte Bindung zurückzuführen sind. Aus Platz- und Zeitgründen stellen wir hier keine Sequenzvergleiche zur Beantwortung dieser offensichtlichen Frage an. Wenn andere Forschungsgruppen bei solchen Vergleichen keine bekannten Phorbolester-Rezeptor-Motive in der Familie der TRPV4-Kanäle finden, würde das bedeuten, dass man ein völlig neues Sequenzmotiv für die Bindung von 4α-Phorbol-Verbindungen an die TRPV4-Kanäle postulieren muss, oder dass es sich um einen indirekten Wirkungsmechanismus handelt.
Wenn man darüber nachdenkt, wie die Details eines indirekten Wirkmechanismus von 4α-PDD auf TRPV4-Kanäle aussehen könnten, kann man sich leicht vorstellen, wie 4α-PDD mit einer PKC oder einem ähnlichen Phorbolester-Rezeptor in einer Weise zusammenspielen könnte, die verschieden genug ist von der klassischen Interaktion zwischen PMA und PKC, um ein deutlich anderes Profil an biologischen Aktivitäten hervorzurufen als PMA, so wie es jetzt in den Untersuchungen von Watanabe et al berichtet wird. Es gibt bereits umfangreiche Belege, die darauf hinweisen, dass sogar Phorbolester-Analoga mit fast unmerklichen strukturellen Unterschieden zwar alle an Mitglieder der PKC-Familie binden können, dass sie sich aber gleichzeitig darin unterscheiden, zu welchem zellulären Ort die entstehenden Bindungskomplexe gelenkt werden. Diese topologische Kontrolle könnte auch im Fall von 4α-PDD wirken, wobei sowohl PMA als auch 4α-PDD an eine PKC oder ein anderes Phorbolester-Rezeptorprotein binden würden, dann aber dazu neigen, die entstehenden Komplexe an unterschiedliche zelluläre Orte zu steuern, z. B. in die Nähe unterschiedlicher Kinasesubstrate.
Als Erklärung für die Wirkung von 4α-PDD auf TRPV4-Kanäle bleibt aber immer auch noch die Möglichkeit eines unspezifischen Effekts. 4α-PDD ist ein nicht-ionisches Molekül, einem Detergenz ähnlich mit einer polaren Kopfgruppe und einem langen hydrophoben Rest, und es ist somit vorstellbar, dass es die Ordnung in Membranen und Ionenkanälen auf eine nicht spezifische Art stört. Ironischerweise wurden 4α-Phorbolester wie 4α-PDD selbst als "inaktive, negative Kontrollen" für detergenz-ähnliche oder andere unspezifische Wirkungen der PKC-aktivierenden Phorbolester verwendet. Daher bräuchte man im vorliegenden Fall "eine Kontrolle für die Kontrolle", d. h. ein Analogon zu 4α-PDD, das ähnlich hydrophob ist und eine detergenz-ähnliche Struktur hat, das aber inaktiv ist gegenüber allen potenziellen Zielsubstanzen wie TRPV4-Kanälen, PKC-Familienmitgliedern und anderen Phorbolester-Rezeptorproteinen. LC Laboratories wird vielleicht demnächst in der Lage sein, eine solche Substanz anzubieten.
Um sich mit den Details der Interaktion von 4α-PDD mit seinem biologischen Zielmolekül zu beschäftigen, würde man sich vielleicht wünschen, eine Ligand-Protein-Bindung untersuchen zu können, indem markiertes 4α-PDD in einem Rezeptorbindungsversuch eingesetzt wird. Leider könnte sich dies im Fall von 4α-PDD als ziemlich schwierig herausstellen, weil (i) die Bindung nicht besonders stark ist (nur ungefähr 400 nM, verglichen mit ca. 1 nM für die Phorbolesterbindung an PKC) und (ii) es ausgesprochen hydrophob ist. Letztere Eigenschaft ist besonders problematisch, weil der typische Komplex aus Phorbolester und Rezeptor die Gegenwart von ziemlich viel Phospholipid benötigt, an das voraussichtlich große Mengen von 4α-PDD unspezifisch binden würden. Zusammengefasst bedeutet dies, dass der aktive 4α-PDD/Rezeptor-Komplex, ob PKC-ähnlich oder nicht, in diesem Fall wegen der erdrückenden Menge an unspezifisch gebundenem, markiertem 4α-PDD nicht gemessen werden kann. Dies würde jegliche spezifische Bindung in einem typischen Versuchsansatz, der Membranlipide enthält, überdecken.
Betrachtet man die Beziehung zwischen Struktur und Aktivität, so sieht es so aus, dass unter den 4α-Phorbolen bis heute nur die Wirkung von 4α-PDD auf TRPV4-Kanäle beschrieben wurde. LC Laboratories bietet auch andere 4α-Phorboldiester an mit unterschiedlicher Hydrophobizität; diese können vermutlich für Struktur-Aktivitätsuntersuchungen im Fall der TRPV4-Aktivierung verwendet werden. Insbesondere bieten wir 4?-PMA (Kat.-Nr. P-8880) und 4α-Phorbol-12,13-Dibutyrat (4α-PDBu; Kat.-Nr. P-4678) an, die beide (besonders 4α-PDBu) weniger hydrophob als 4α-PDD sind.
Diese Analoga zu 4α-PDD können von erheblichem Nutzen sein. Die hohe Hydrophobizität (hoher Lipid-Verteilungskoeffizient) von 4α-PDD führt dazu, dass es ziemlich gut löslich in zellulären Membranräumen ist, und es wird allgemein angenommen, dass es sehr schwierig ist, diese Substanz aus Membranpräparaten oder Zellkulturen auszuwaschen. Es könnte sich herausstellen, dass 4?-PMA und 4α-PDBu weniger wirksam sind als 4α-PDD, aber wenn sie noch genügend Wirksamkeit zeigen im Vergleich zu 4α-PDD, würde man sie als Forschungshilfsmittel vorziehen wegen ihrer größeren Fähigkeit, sich zwischen wässrigen und lipiden Zellräumen gleichmäßig zu verteilen, und weil sie aus Versuchspräparaten ausgewaschen werden können.
Zusätzlich zu 4α-PMA und 4α-PDBu haben wir in der Vergangenheit andere 4α-Phorboldiester hergestellt, z. B. 4α-Phorbol-12,13-Diacetat, eine sehr wenig hydrophobe Substanz. Diese anderen 4α-Phorbolderivate sind zur Zeit nicht als LC Labs-Produkte aufgeführt, können aber auf Wunsch geliefert werden. Ebenso können Sie größere Mengen all unserer 4α-Phorbolprodukte mit erheblichem Rabatt erhalten.
Chemische Strukturen. Der wichtigste strukturelle Unterschied zwischen 4α-PDD und den hoch wirksamen PKC-Aktivatoren vom Phorbolestertyp ist die Konfiguration am C4. In der hoch aktiven Phorbolesterfamilie ist die Hydroxylgruppe am C4 in der β-Konfiguration, d. h. aufsteigend, nach oben herausragend aus der zweidimensionalen Struktur, wie man sie auf dem Papier oder einem Computerbildschirm sieht. Bei den 4-α-Phorbolestern wie 4α-PDD, 4α-PMA und 4α-PDBu zeigt die 4-OH-Gruppe nach unten unter die Ebene des Papiers oder des Bildschirms.
Nomenklatur. Außer wenn "4α" angegeben ist, sind alle "Phorbol-"Verbindungen automatisch durch die übliche chemische Nomenklatur so definiert, dass sie die 4β-Konfiguration besitzen, weil dies Teil der Bedeutung des Wortes "Phorbol" ist. Ähnlich verhält es sich mit dem Wort "Cholesterin", das automatisch bedeutet, dass seine Hydroxylgruppe am Kohlenstoff 3 in der β-Konfiguration ist; man braucht also nicht extra "3β-Cholesterin" zu schreiben, während man aber ein Cholesterinderivat mit einer 3α-Hydroxylgruppe als "3α-Cholesterin" bezeichnen müsste. Um Verwirrung auf diesem Gebiet zu vermeiden, sollte man beachten, dass technisch gesehen 4α-PDD kein "Phorbolester" ist, sondern ein "4α-Phorbolester" und obwohl die strukturellen Unterschiede im Ganzen gering sind, sind sie biologisch doch höchst bedeutsam. Angesichts der außerordentlich großen Unterschiede in ihren biologischen Wirkungen, sowohl was das PKC- als auch was das TRPV4-Kanal-Phänomen betrifft, sollte man sich bemühen, unverwechselbare Namen für die Mitglieder dieser zwei biologisch völlig verschiedenartigen Stoffklassen zu verwenden.
Nur für den Laborgebrauch oder für Herstellungszwecke; nicht für die Anwendung am Menschen, an Tieren, in der Nahrung oder im Haushalt.
